Šv. Onos bažnyčia Žemutinėje pilyje minima 1390 m. Ji stovėjo Gedimino kalno šiaurinėje papėdėje ir priklausė pranciškonams.
Žygimantas Augustas, pargabenęs iš Krokuvos į Vilnių Barboros Radvilaitės palaikus, nusprendė statyti bažnyčią, skirtą savo šeimos mauzoliejui. Nugriovus senąją Šv. Onos bažnyčią iki pamatų jos vietoje Žygimanto Augusto iniciatyva buvo pradėta statyti didesnė Šv. Onos ir Šv. Barboros bažnyčia, kurios statyba truko daugiau nei 20 metų. Tačiau 1572 m. ji dar nebuvo baigta.
Žygimantas Augustas testamente nurodė užbaigti bažnyčią ir perkelti iš Katedros karalienių Elžbietos Habsburgaitės ir Barboros Radvilaitės palaikus.