Prieš dabar išlikusio sinagogos pastato pastatymą 1841 m., jo sklypo vietoje jau stovėjusi pirmtakė sinagoga, kurią nuplovė vienas iš tuomet dažnų Vilnelės potvynių. Toje pačioje vietoje iškilo nauja mūrinė vieno aukšto sinagoga, o 1891 m. gausėjanti vietos žydų bendruomenė inicijavo pastato rekonstrukciją – taip šiaurinėje pastato dalyje pristatyta moterų dalis, taip pat išdidinti pamaldų salės langai. Išskirtinį bendruomenės rūpestį sinagoga parodė ir tai, jog dar 1915 m. pastato apšvietimui buvo įvesta elektra – visiška naujovė ir privilegija to meto Zareche. Sinagoga buvo esminė Užupio žydų bendruomenės susitikimo vieta, juolab ji stovėjo šalia pagrindinio kelio, vedančio į Naująsias Užupio žydų kapines, tad laidojimo procesijos dažnai sustodavo joje siekiant pagerbti laidojamą asmenį. Vis tik labiausiai ją už bendruomenės ribų išgarsino XIX a. 5 deš., kuomet čia dirbo ir vadovavo šalia esančiai ješivai Musar judėjimo pradininkas Izraelis Salanteris.

Vokiečių okupacijos metais Užupio sinagoga buvo stipriai suniokota, o sovietinės okupacijos laikotarpiu pastatas perdarytas į gyvenamuosius butus. Atkūrus Lietuvos nepriklausomybę prireikė 16-kos metų, kad būtų atkreiptas dėmesys į šį žydų kultūros paveldo objektą, bet 2006 m. pastatas pagaliau buvo rekonstruotas.